药敏实验纸片扩散法的操作步骤

　　药敏实验纸片扩散法是一种用于检测细菌对抗菌药物敏感性的实验方法，它通过观察含有定量抗菌药物的纸片在已接种待检菌的琼脂平板上形成的抑菌圈的大小，来判断细菌对药物的敏感程度。以下是对药敏实验纸片扩散法操作步骤的具体介绍：

　　

　　1、准备材料：确保所有设备和材料处于良好状态，包括恒温培养箱、比浊仪、0.45%NaCl溶液、一次性使用拭子、无菌医用棉签、游标卡尺、镊子等。同时，准备好水解酪蛋白（Mueller-Hinton，M-H）培养基，其PH值应为7.2-7.4，这是CLSI推荐的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基。

　　

　　2、制备菌悬液：选择适当的方法制备接种菌液。直接菌落法是用一次性拭子挑取生长在无选择性琼脂平板上的新鲜菌落，悬浮于0.45%生理盐水中，混匀后调整浊度至0.5麦氏浊度。肉汤增菌法则是将单个菌落接种至肉汤培养基，孵育并调整浊度至0.5麦氏浊度。

　　

　　3、接种平皿：用无菌医用棉签蘸取调好的菌液，在试管内壁将多余的菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种三次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹一周。

　　

　　4、贴抗菌药物纸片：接种好的药敏平板在室温下放置3~5分钟后，用无菌镊子将药敏纸片贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。

　　

　　5、孵育：贴上纸片后，须在15分钟内倒置平板，并放入35℃孵箱中培养18~24小时。对于某些特殊抗菌药物如苯唑西林或万古霉素，孵育时间需延长至24小时。

　　

　　6、结果判读：用游标卡尺测量抑菌圈直径，测量时应将平板置于黑色背景下，肉眼判读。根据抑菌圈的大小，可以判断细菌对药物的敏感程度，并据此报告“敏感”、“剂量依赖性敏感”、“中介”、“耐药”和“非敏感”等结果。

　　

　　总的来说，药敏实验纸片扩散法是一种重要的微生物学实验方法，它通过简单的操作步骤和直观的结果判读，为临床医生提供了关于病原微生物对抗菌药物敏感性的重要信息。